Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup> +</sup> Putatifs cellules souches du cancer du mélanome
Summary
Cet article décrit la préparation de tissus mélanome fraîchement obtenu dans des cultures de cellules primaires, et comment supprimer les contaminations des érythrocytes et des fibroblastes à partir des cellules tumorales. Enfin, nous décrivons comment CD133<sup> +</sup> Putatifs cellules souches de mélanome sont triés du CD133<sup> -</sup> En vrac en utilisant magnétique tri cellulaire activé (MACS).
Abstract
Malgré l'existence de traitements améliorés pour les mélanomes disponibles aujourd'hui, les patients atteints de mélanome malin avancé encore un mauvais pronostic pour la survie sans progression et globale. Par conséquent, la recherche translationnelle doit fournir une preuve supplémentaire moléculaire pour améliorer les thérapies ciblées pour les mélanomes malins. Dans le passé, les mécanismes oncogéniques liés au mélanome ont été largement étudiées dans des lignées cellulaires établies. Sur le chemin de traitements plus personnalisés basés sur les profils génétiques, nous proposons d'utiliser des lignées cellulaires dérivées de patients au lieu de lignées cellulaires génériques. Avec les données cliniques de haute qualité, en particulier sur le suivi des patients, ces cellules seront déterminants afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine la progression du mélanome.
Ici, nous présentons la mise en place des cultures de mélanomes primaires de tissu tumoral frais disséqués. Cette procédure comprend le hachage et la dissociation du tissu dans des cellules individuelles, reDépose des contaminations avec des érythrocytes et des fibroblastes ainsi que la culture primaire et de vérification fiable de l'origine des cellules de mélanome.
De récents rapports ont révélé que les mélanomes, comme la plupart des tumeurs, le port d'une petite sous-population de cellules souches cancéreuses (CSC), qui semblent exclusivement alimenter l'initiation et la progression tumorale vers le stade métastatique. L'un des principaux marqueurs pour l'identification et l'isolement du SCC dans le mélanome est CD133. Pour isoler CD133 + CSC à partir de cultures primaires de mélanome, nous avons modifié et optimisé le tri cellulaire magnétique actif (MACS) procédure de Miltenyi résultant de la pureté de tri haute et la viabilité de CD133 + et CD133 CSC – en vrac, ce qui peut être cultivée et fonctionnellement analysé par la suite.
Introduction
Mélanomes malins cutanés sont le type le moins fréquent, encore plus mortelle de cancer de la peau. En raison d'une incidence croissante, un haut grade de malignité et d'une diffusion rapide, les mélanomes comptent maintenant pour 75% des tumeurs malignes de la peau liées 1,2 décès. En plus de l'exérèse chirurgicale de la tumeur primitive, chimiothérapie, radiothérapie, immunothérapie et combiné chimio-immunothérapie du mélanome et des métastases sont les stratégies state-of-the-art pour le traitement du mélanome 3,4. Toutefois, le mélanome malin est caractérisée par une faible réponse aux agents chimiothérapeutiques (5-12%) 5,6, et seulement ceux 50-70% de patients atteints de mélanome portant le gène BRAF V600E avantage mutation du gène de promettre de nouvelles thérapies ciblées que le traitement avec vemurafenib 7 Pour améliorer la survie globale, une meilleure compréhension des mécanismes de la tumorigenèse du mélanome est nécessaire.
Pour étudier ces mécanismes dans le passé, bien établi commercialement des lignées cellulaires disponibles ont été utilisés. Des approches plus récentes pour étudier les événements moléculaires de l'initiation et la progression du cancer utilisent des cultures primaires dérivées directement à partir de tissu tumoral – une stratégie avantages multiples paliers: Le chercheur a le plein contrôle du patient et de la sélection des tissus. Les cellules prélevées acquise dans le tissu tumoral sélectionnés par des experts, ressemblent à la tumeur avec tout son hétérogénéité et de suivi des données du patient et une pathologie détaillée est disponible pour permettre aux caractéristiques de la culture à comparer avec ceux de la tumeur d'origine 8.
En revanche, l'utilisation de lignées cellulaires établies comme des systèmes modèles pertinents en recherche sur le cancer est l'objet de controverses. Déjà en 1987, Osborne et ses collègues ont décrit des différences biologiques entre les MCF-7 lignes cellulaires cancéreuses mammaires de différents laboratoires 9. Cette instabilité génomique vaste et la variation de l'expression des ARN au cours de la sous-culture a été confirmed par Hiorns et al. ont fourni des données et de soutien pour preuve que les lignées cellulaires ne évoluera dans la culture, ce qui affaiblit la pertinence directe de ces cultures établies comme des modèles du cancer humain 10.
Une autre considération importante, qui a été largement ignoré au cours des années, est le risque de contamination ou de prolifération de cultures sans rapport avec «fausses» les cellules, ce qui a d'abord été mis en évidence il ya vingt ans, en démontrant qu'un grand nombre de lignées de cellules HeLa ont été contaminés par 8,11 cellules. La mauvaise interprétation des données de «faux» des lignées cellulaires a récemment mis au jour dans la littérature à nouveau. En utilisant une combinaison de profilage de l'ADN et la cytogénétique moléculaire, MacLeod et al. Ont révélé que de 252 nouveaux dérivées de tumeurs des lignées cellulaires humaines déposé à la Collection allemande de microorganismes et de cultures cellulaires (DSMZ), près de 18% ont été jugés intraspécifique ou interspécifique croix -contaminants 12,13.
Pour éviter ces problèmes et de faire usage des avantages mentionnés ci-dessus, nous avons décidé de mettre en place à faible passage des lignées de cellules de mélanome de métastases fraîchement excisées.
Robustes cellulaires technologies de séparation et d'analyse nécessitent unicellulaires préparations destinées à être produite tout en limitant la mort cellulaire et la destruction des protéines de surface caractéristiques. Un instrument de paillasse pour la dissociation automatisée des tissus dans une seule cellule suspensions est le Dissociator gentleMACS fabriqué par Miltenyi. Lorsqu'il est utilisé en combinaison avec gentleMACS C Tubes et optimisé solutions dissociation, une dissociation efficace et doux de tissu tumoral dans un système fermé est obtenu tout en préservant épitopes d'antigènes et de réduire la perte de cellules. L'instrument offre optimisées, programmes pré-établis pour une variété d'applications spécifiques et des garanties de préparation standardisée des suspensions unicellulaires à partir de 14 tissus mélanome.
<p class = "jove_content"> De récents rapports ont révélé que la majorité des tumeurs abritent une petite sous-population de ce qu'on appelle les cellules souches cancéreuses (CSC), qui présentent exclusivement des tumeurs initiation et la capacité d'auto-renouvellement. L'identification des cellules souches des mélanocytes qui produisent dans le derme de la peau conduit à l'hypothèse que ces cellules pourraient être à l'origine des cellules souches cancéreuses (CSC) dans le mélanome depuis l'exposition aux UVA peut amorcer ces cellules pour la transformation maligne 15. Le résultat d'une telle lésion génétique serait cellules qui abritent une combinaison de caractéristiques de la tumeur et les cellules souches.L'un des marqueurs principaux proposés pour représenter la sous-population des CSC dans le mélanome est CD133 16-20. CD133 (également connu sous le nom prominine 1), un membre de glycoprotéines transmembranaires PENTASPAN, est exprimé dans les cellules souches hématopoïétiques, les cellules progénitrices endothéliales, les cellules souches neuronales et gliales 21-23. L'expression de CD133 est en corrélation avecla division cellulaire asymétrique 24, et l'épitope glycosylé de CD133 a été montré pour être régulée à la baisse sur 25 différenciation cellulaire. Récemment, CD133 + cellules de mélanome ont été montré pour avoir l'auto-renouvellement et la tumeur initiation capacité de 19,20.
Pour étudier la fonction de CD133 + mélanome putatif CSC, nous avons modifié et optimisé le tri cellulaire magnétique actif (MACS) système de Miltenyi Biotech pour obtenir des populations hautement enrichi et viable de CD133 et CD133 + – cellules.
Séparation magnétique de cellules à base de billes permet soit la sélection négative comme le montre Matheu et al. 26 ou la sélection positive comme nous le montrons ici. Lors de la sélection du type positif cellule cible particulière, par exemple des cellules exprimant CD133, est marqué magnétiquement avec des microbilles, des particules superparamagnétiques 50-nm qui sont conjugués à des anticorps très spécifiques contre unparticulier antigène de surface cellulaire. Lors de la séparation, les cellules marquées magnétiquement sont retenus à l'intérieur de la colonne dans le champ magnétique du séparateur, tandis que les cellules non marquées de les traverser. À la suite des étapes de lavage, la colonne est retirée du champ magnétique du séparateur, et les cellules cibles sont éluées de la colonne. Le LS ou colonnes MS utilisé pendant résultat de la sélection positive en fractions de cellules marquées et non marquées avec une grande pureté. D'autre part, les colonnes LD, utilisés pour la sélection négative, conduisent à une pureté légèrement inférieure de la fraction marquée. En raison de la plus dense d'emballage de leur matrice du débit dans ces colonnes est inférieur résultant en un risque plus élevé de cellules non marquées à être piégés dans la colonne. Colonnes LD devrait donc être utilisé que pour l'épuisement sévère d'une sous-population de cellules indésirables. Sélection positive peut être réalisée par marquage magnétique directe (anticorps couplé à des microbilles) ou indirecte (incubation avec des microbilles suivant la incubation avec l'anticorps primaire). Spécifiques microbilles MACS sont disponibles pour la sélection positive de nombreux types cellulaires de cellules tumorales primaires comme la prostate ou de mélanome 27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin d'éliminer les contaminations érythrocytaires de la cellule tumorale pellets nous recommandons fortement d'utiliser la solution de lyse des globules rouges à partir de Miltenyi. Les avantages de la lyse des érythrocytes au cours de la centrifugation sur gradient de Ficoll densité traditionnelle est qu'il est plus rapide et plus simple. De plus, les contaminations par Ficoll ou de globules rouges et de la perte des cellules tumorales sont évités. Lorsque vous observez la croissance des fibroblaste…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Professeur M. Dietel et Dirk Schumacher pour soutenir ce travail et la lecture critique du manuscrit.
Les recherches menant aux présents résultats ont bénéficié du soutien de l'entreprise Initiative médicaments innovants conjoint en vertu de convention de subvention n ° 115234, les ressources qui sont composées de la contribution financière du Programme de l'Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) et les entreprises EFPIA »dans contribution en nature. Ce travail a également été soutenue par le Krebsgesellschaft Berliner (BKG).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipment | |||
| Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
References
- Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
- Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
- Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
- Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
- Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. . Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).
- Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
- Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
- Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
- Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
- Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
- Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
- MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
- Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
- Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
- Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
- Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
- Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
- Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
- Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
- Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).
